Loading... # 基于离子迁移率的甾体组学揭示小鼠脑内不同的甾醇脂质的空间和时间特征 * 甾醇类脂 * 作用 * 其代谢稳态对维持生物体的正常细胞功能至关重要 * 甾醇脂质代谢异常与心血管疾病、癌症、神经退行性疾病有关 * 人类大脑含有20%的胆固醇 * 大脑中，胆固醇只能原位合成，并作为代谢前体转化为其他重要的类固醇脂质 * 大脑的不同功能区，甾醇脂质的分布不均 * 甾醇脂质的变化同脑部疾病有关联 * **年龄**是神经退行性脑疾病发展的一个相当大的风险因素 > 因此，深入描述大脑复杂功能区的空间和时间甾醇分布特征，有助于全面理解由甾醇脂质代谢支持的脑部疾病的病理机制 > * 难点 * 甾醇浓度低、电离效率低 * 86%的甾醇具有异构体，难以大规模分析 * 缺乏全面的四维甾醇脂质数据库 * IM-MS * 可**多维分离**，选择性高，可有效检测代谢物和脂质 * 根据CCS或者Rotationally averaged surface area的差异快速分离离子 > CCS：Collision cross-section，碰撞截面 > > * 与离子的结构与构象有关，可快速分离同分异构体 > > Rotationally averaged surface area： > * LC-与IM-MS串联，可全面获取生物样品中四个维度的小分子信息 * MS1的m/z，保留时间RT，CCS，MS/MS谱图 > 有必要开发一种高精度和广泛的甾醇脂类的分析策略 > # 结果 ## 采用衍生化和IM-MS技术改进甾醇异构体的分离 > derivatization：衍生化 * 衍生化的原因 * 甾醇类脂的浓度低 * 如何为吡啶衍生物 * 大多数甾醇脂质含有羟基 * 衍生化的效果 * 吡啶甲酰衍生化，改善了甾醇异构体的离子迁移率 > 如表雄酮和黄胆酮，衍生化后CCS差值从0.4%扩大到12.8% > > 通过包含97中甾醇的库验证，衍生化后，67.2%的甾醇异构体具有显著的CCS差异，而未衍生化的只有38.0% > * 主要加合物为[M+H-H2O]+或[M+H-2H2O]+的未酰化甾醇脂类，水分子的损失可能会导致异构性的损失 * 基于LC-IM的二维分离可以进一步提高衍生化甾醇的分离效果 > 根据IM、LC和基于LC-IM的二维方法分离的甾醇异构体的峰分辨率，用125对衍生化甾醇异构体验证 > * 在IM分离时，42.4%的异构体对有良好的峰分辨率 * 在LC分离时，68.8%的异构体对有良好的峰分辨率 > **综上，证明**了利用LC-IM-MS多维分离技术，吡啶甲酰衍生化提高了甾醇分析中异构体的分离效果 ## 支持机器学习的甾醇脂质四维分析库 ### 各个维度 1. 维度1：LMSD中检索到具有3068种甾醇脂质的MS1文库 2. 维度2：预测的RT 3. 维度3：预测的CCS 4. 维度4：按碎裂规则预测的MS/MS谱库 ### 数据集训练与验证 标准ST文库中57%的甾醇用作训练数据集，43%用作外部验证数据集。 > 验证结果： > > * CCS预测：R2，0.8690，中位相对误差1.75% > * 外部验证：RT，R2，0.9813，中位误差22s > * 预测扩展ST文库中所有甾醇的相关特征片段， ## 基于IM-MS的甾醇四维分析 * 对常见生物样品中的甾醇脂质进行四维分析，鉴定出278种甾醇脂质，来自4大类19个亚类 * 分析结果  * 主要甾醇：ST01 * 胆固醇及其衍生物，31% * 麦角甾醇及其衍生物，18% * 豆甾醇及其衍生物，15% > 利用标准ST文库鉴定了20-21个甾醇，并用化学标准进一步确认，根据MSI的定义，分为2个Level，定为Level 1 > >  > > 利用扩展ST文库的四维鉴定技术鉴定65-176甾醇，定位Level 2 > * 脑组织中，特征M528T849C269被标记为菜籽甾醇，M540T795C268被标记为14-去甲基羊毛甾醇 * 4个特征可用于MS1匹配 * 使用RT、CCS和MS/MS谱验证假阳性   ## 小鼠脑内甾醇脂质的空间分布多样性 ### 现状 报道了甾醇脂质再小鼠大脑中的分布，但缺乏不同脑区的分布和功能的关联性 ### 结果 #### 位置分布 解剖小鼠大脑的十个功能区，使用四维技术对甾醇进行定量测量，鉴定了**14个亚类的197中甾醇脂质** >  > >  > > * olfactory bulb：嗅球 > * anterior cortex：前皮质 > * posterior cortex：后皮质 > * hippocampus：海马 > * cerebral nuclei：脑核 > * interbrain：脑间 > * midbrain：中脑 > * pons：桥脑 > * medulla：髓质 > * cerebellum：小脑 * **所有大脑区域中含有51中ST01类甾醇脂质**，表明这些甾醇再整个大脑的正常生理活动中至关重要  #### 浓度分布 * **胆固醇**在所有脑区中含量最**丰富**，且浓度范围最宽 * **所有甾醇**在不同脑区的**浓度范围都很大**，最高可达8个数量级 * 胆固醇衍生物、麦角甾醇衍生物和豆甾醇衍生物含量最为丰富 * 螺甾醇衍生物在7/10的脑区中浓度最低 * 进行one-way ANOVA分析，149中脂质在统计学上发生了变化（p<0.05），HCA * 簇1，53%为Oxysterols，其在脑核和嗅球中含量高，小脑中含量低 * 簇2，62%为Phytosterols，在延髓和脑桥中含量高，前皮层和小脑中含量低 * 簇3，胆固醇衍生物和其他甾醇的混合物 > 因素为脑区，即探究各种甾醇的含量分布是否与脑区有关 > > HCA，系统聚类分析 > > 不同脑区，甾醇脂质的空间分布不同 > > 甾醇脂质的**区域特异性**分布表明大脑各区域的不同功能可能需要不同的甾醇代谢 > ### 小鼠脑内年龄相关脂质的空间分布多样性 * 对6周龄和68周龄小鼠的10个脑区进行年龄相关甾醇脂质差异定量分析 * 102种甾醇在至少一个脑区表现出显著的年龄差异  * 进一步对单个脑区分析，发现随年龄的增长，甾醇脂质变化明显 * 衰老过程中，77种甾醇脂质在间脑中显著变化 * 嗅球中只有4种 * 每个脑区因衰老而引起的变化模式是双向的  * 衰老过程中，脑间的甾醇脂质含量变化最大，嗅球的甾醇脂质含量未增加，所有脑区的甾醇含量均下降  * 24-HC为胆固醇通过BBB外流的主要形式 > 24-HC：24-hydroxycholesterol，24-羟基胆固醇 > * 6周龄小鼠，cerebral nuclei和interbrain中含量丰富，cerebellum含量极低 > 与24-HC酶CYP46A1合成酶在各脑区的表达情况一致 > * 68周龄小鼠，posterior cortex, anterior cortex, cerebral nuclei, medulla, and cerebellum中含量丰富 * 不同脑区中甾醇含量的共同调节 * Pearson相关性分析，分析6/68周龄小鼠 * 发现220对正相关和3对负相关甾醇脂质 * 如10个脑区中，24-HC和7-脱氢胆固醇在年轻和老年小鼠之间为正相关 * 外源植物甾醇、谷甾醇和环青蒿醇呈负相关  * 与年龄相关的甾醇脂质之间具有更多的正相关性 * 为每个脑区建立网络 * the networks for the anterior cortex, hippocampus, cerebral nuclei, midbrain, pons, and medulla displayed bimodal separation > 双峰现象表明，相关脑区，与年龄相关的甾醇脂质代谢明显不同 > * 老年小鼠的大脑，多数协同调节的甾醇脂质水平均降低 * 嗅球、后皮质和间脑中没有观察到这一特征 * 尽管前后皮质生理结构相似，但协同调节的甾醇脂质水平在老年小鼠大脑的前皮质升高，后皮质降低 > 描绘的小鼠大脑中甾醇脂质的空间和时间多样性，揭示了与年龄相关的甾醇脂质在每个脑区之间的相互作用 > # 讨论 1. 问题1：大脑中甾醇含量少，且质谱较难分析甾醇的异构体 * 证明吡啶基衍生化和IMS结合，通过**IMS下衍生化异构体旋转平均表面积的增大**以大大提高甾醇异构体的分离效率 2. 缺乏甾醇的标准和全面的四维甾醇数据库，无法实现IM-MS对甾醇脂质的大规模深入表征 * 开发了由**机器学习得到的数据库**用以支持IM-MS的分析 * 四维数据库包括**m/z，CCS，RT和MS/MS谱** * 应对复杂的生物样品，可从**14个甾醇亚类中识别278种甾醇脂质** 3. 基于IM-MS技术在甾醇识别方面的局限性 > 1. 遗漏吡啶甲酰衍生物 > * 重要的胆固醇酯（CE）和无羟基的甾体化合物 > 2. 可用甾醇标准的数量有限 > * 可用甾醇标准的数量有限，影响了扩展ST库中预测的CCS的准确性，进而导致错误的甾醇鉴定 > * 使用标准ST文库的实验CCS值来鉴定Level 1甾醇脂质 * 使用预测的CCS值匹配Level 2甾醇脂质 * 估计嗅球样本中类固醇的错误发现率（FDR），随着样本的增加，FDR显著降低。当CCS匹配容差设置3%时，估计FDR1.4% > 嗅球是甾醇含量最高的脑区 > > 四维方法可以很高的精度表征生物样品中的甾醇类脂 > > 通过扩大训练数据集的规模，开发其他机器学习算法如神经网络，进一步提高CCS的预测精度 > 4. 甾醇脂质在大脑中的分布不均匀，因此可以通过量化其分布以分析某些疾病的发病机制 * Secostero-B与AD发病机制的关系未知，但其聚集时前皮层独有的 * 植物甾醇在延髓和脑桥中含量丰富，与PD的病理生理学有关，由于其只能从饮食中获得，因此在脑中的水平反应了肠道的吸收能力。 > 进一步研究脑区特异性植物甾醇的富集与肠道吸收和转导的相关性，对阐明PD的发病机制很重要 > 5. 甾醇脂质受年龄影响，具有脑区特异性，但相关小鼠样本较少 * 间脑的甾醇受年龄影响最深，表现出最多的甾醇脂质变化和广泛的幅度变化 * 嗅球不太容易受到年龄的影响， > 间脑和嗅球的差异，可能与两个脑区的不同功能有关，且揭示了不同脑区的不同功能需要不同的甾醇代谢 > * 网络分析揭示了十个脑区甾醇的共同调节，甾醇严格协同调节，对衰老做出反应。 * 与年龄相关的甾醇脂质水平的变化在空间上是不同的 # 样品处理 ## 小鼠脑解剖 > （C57BLJ6；雌性；6周和68周，每组n=6个生物学上独立的样本） * 脑组织于在冷冻过的解剖缓冲液中徒手分离不同脑区，过程中通入95%O2/5%CO2（pH 7.4）气体，以避免神经兴奋毒性并保持活力。 > 解剖缓冲液：212.7mM蔗糖、5mM KCl、1.25mM NaH2PO4、10mM MgCl2、0.5mM CaCl2、26mM NaHCO3和10mM葡萄糖 > * 分离完毕，将脑组织直接冷冻在液氮中 ## 甾醇提取 * 冷冻脑组织称重，每mg组织中加入20μL的H2O，10μLBHT，均质时使用液氮冷却。 > BHT：6.5μg溶于10μL甲醇中，避免样品制备过程中可能发生的氧化 > * 均质完毕，每个样品取100μL溶液，混合30μL氘代内标溶液（IS；10 ng d6-去氢甾醇、10 ng d7-胆固醇和10 ng d6-27-羟基胆固醇）混合，并通过添加H2O进一步稀释至200μL。800微升萃取溶剂DCM/MeOH（2:1；v/v），含有6。加入5μg BHT进行提取。 * 将溶液旋转30 s，然后进行10 min的超声波处理，并在900×gat 4°C下离心15 min。收集底部有机层（400μL）。向剩余层中添加额外的400μL DCM以进行重新提取。提取总共重复三次。使用真空浓缩器（LABCONCO）在4°C下蒸发汇集的有机层。 ## 水解 对于水解，将干燥提取物与500 μL含1.0 M氢氧化钾和6.5 mg BHT的甲醇溶液混合。涡旋溶液30 s，超声处理10 min，37 ℃孵育1 h，然后加入1 mL己烷进行提取。涡旋样品30 s，在4 ℃水浴中超声处理10 min，并在900×gat 4 ℃下离心15 min。收集所得上清液(600 μL)。对于第二次提取，加入1.0 mL己烷，取1.0 mL上清液，并在第一次提取中与上清液合并，最后使用真空浓缩器在4 ℃下蒸干。 ## 衍生和样品清洗 根据先前方法进行甾醇衍生化，并进行微小修改23。依次将衍生化化学品（包括吡啶甲酸(53.3 mg)、2-甲基-6-硝基苯甲酸酐(66.7 mg)和4二甲基氨基吡啶(3 mg)）加入吡啶(1 mL)中。向干燥提取物中加入新鲜制备的衍生试剂(200 μL)和5.36 μL三乙胺。涡旋反应混合液30 s，超声处理10 min，80 ℃孵育60 min。然后向样品中加入1 mL己烷进行浸提。涡旋样品30 s，超声处理10 min（4 ℃水浴），4 ℃900×gat离心15 min。最后，收集上清液，并使用真空浓缩器在4 ℃下蒸干。将衍生化后的干提取物与400µL二氯甲烷和600µL of H2O混合，用于样品清洁。然后涡旋溶液30 s，在4 ℃水浴中超声处理10 min，并在900×gat 4 ℃下离心15 min。然后，除去400 μL上层水层。然后，向剩余样品溶液中再加入400 μL of H2O进行清洁。清洁步骤重复两次。收集剩余有机层，并使用真空浓缩器在4 ℃下蒸干。将干燥提取物保存在-80 ℃下，并在LC-IM-MS分析前使用100 μL ACN复溶。对于胆固醇分析，分析前首先使用ACN将样本稀释50倍。 为制备小鼠肝组织样本，处死前用异氟烷蒸汽麻醉小鼠（C57BLJ6；n = 6；24周），迅速取肝脏，并在冰上解剖。解剖的肝脏立即液氮冷冻，-80 ℃保存，用于随后的固醇脂质提取。本实验中的小鼠购自上海模式生物中心（中国上海）。对冷冻的肝组织进行称重并匀浆。然后，取50 μL匀浆溶液进行样品制备。其余操作同脑组织的制备。对于人血浆的制备，使用10 μL血浆进行固醇提取。程序同脑组织的制备。人血浆购自Equitech-Bio（目录号：HPH-0500,TX,USA）。 # 质谱分析 采用Agilent DTIM-QTOFMS 6560 和 UHPLC 1290 采用Phenomenex Kinetex C18色谱柱（粒径，1.7 μm；100 mm（长）×2.1 mm（内径）），柱温50℃，流动相（a，含0.1%乙酸的水；B，含0.1%乙酸的甲醇）进行梯度分离。 * 色谱参数： * 洗脱梯度和流速： * 0-3 min：0%B～25%B * 3-5 min：25%B～85%B，流速为0.4 mL/min； * 5-5.1 min，85%B等度步长，流速增加至0.6 mL/min； * 5.1-14 min，85%B～93%B，流速为0.6 mL/min。维持3 min，然后在0.2 min内升温至100%B，并保持1.8 min。在0.1 min内恢复至初始条件； * 在19.1–19.2 min内维持0%B，流速降至0.4 mL/min； * 用初始条件平衡色谱柱0.8 min。总梯度时间为20 min。 * MS参数： * ESI正离子模式； * 质量范围，124～1300 Da； * 鞘气温度，350 ℃，流量，12 L/min； * 干燥气温度，365 ℃，流量，8 L/min； * 雾化器压力，20 psi； * 毛细管电压，3500v，以氮气为漂移气体，采用单场法测量CCS值。最大漂移时间60 ms，扫描速率设定为0.9帧/秒。漂移管的压力为3.95 Torr，温度为300k，漂移管的入口和出口电压分别设定为1700v和250v。 * 捕集阱填充和捕集阱释放时间分别设定为20,000 μs和150 μs。在“交替帧”模式下采集MS/MS光谱。第1帧碰撞能量设置为0 V，第2帧碰撞能量设置为20 V，采用“靶向MS/MS”模式进行靶向MS/MS采集。 * 使用MassHunter工作站数据采集软件（版本B.08.00，Agilent Technologies，USA）进行所有数据采集。对每个批次运行保留时间质量控制(RTQC)以监测RT偏移并用于RT校准。 # 数据处理 ## 扩展ST文库 1. 将标准ST库中的97种甾醇脂质分为训练数据集和外部验证数据集 2. 从Lipid MAPS和PubChem中获取化学结构 3. 利用R“rcdk”v3.3.8根据SMILES计算221个分子描述符（MD） 4. 使用最小绝对收缩和选择算子（LASSO）算法和训练集选择MD 5. 采用10倍交叉验证优化LASSO中的λ，选择均方误差最低的λ作为最佳模型 6. 选择12个和24个MD，利用R“glmnet”v4.1进行CCS和RT预测 7. 利用支持向量回归（SVR）算法进行CCS和RT预测，该算法利用核函数构建训练数据集中所选MD与CCS/RT值之间的高维回归 > 通过10倍交叉验证和100次重复，从77个参数组合中优化了两个超参数，违反约束的成本(C)和γ，最后使用外部数据进一步验证基于SVR的CCS和RT预测 > ## 甾醇的四维鉴定 > 使用内部包R[“Sterol4DAnalyzer”](https://github.com/ZhuMetLab/Sterol4DAnalyzer)与标准ST文库和扩展ST文库进行四维匹配，对甾醇脂质进行鉴定 1. 通过分析保留时间质控（RTQC）样品进行RT校正 2. 更新了两个文库的甾醇脂质 ## 用化学标准验证已鉴定的甾醇脂质 * 用上述LC-IM-MS/MS方法测定21个甾醇衍生化标准品的RTs、IM漂移时间和脑组织样品。靶向MS/MS采集，碰撞能量为60V或90V ## 定量小鼠脑中甾醇脂质 1. 提取前，在50μL匀浆中添加氘代内标，混合21个甾醇标准品和3个内标物制作标准样品，绘制标曲 2. 分析每个脑区时，在采集批次的开始和结束时，对校准样本进行两次分析，数据由Skyline处理，输入已鉴定甾醇的前提m/z、前体电荷、RTs和CCS 3. 人工积分甾醇脂质峰面积，输出生物样品中已鉴定甾醇的色谱峰面积和3个内标 ## 比较甾醇异构体的CCS差异和峰分辨率 > 将与标准ST文库中质量完全相同的两种甾醇脂质是为一对异构体 1. 检出125对衍生化甾醇异构体，163对未衍生化甾醇异构体，根据式1计算CCS的差异 $$ CCS_{diff}=\dfrac{|CCS_A-CCS_B|}{CCS_A}\times 100\tag{1} $$ 2. 根据式2计算LC分辨率，式3计算IM分辨率 $$ R_{S_{LC}}=\dfrac{2(RT_A-RT_B)}{W_{RT_A}+W_{RT_B}}\tag{2} $$ $$ R_{S_{IM}}=\dfrac{2(CCS_B-CCS_A)}{W_{CCS_A}+W_{CCS_B}}\tag{3} $$ > 分辨率，resolution，R_S：提供两个分析物的分离度的定量度量 > > R_{S_{LC}}，一维LC峰值分辨率 > > RT_{A/B}：A/B的保留时间 > > W_{RT_{A/B}}：A/B的保留时间峰宽 > > Dataset2 > 3. 由式4计算两个正交分离物的二维峰值分辨率 $$ R_S=\sqrt{(R_{S_{LC}})^2+(R_{S_{IM}})^2}\tag{4} $$ ## 构建标准ST文库趋势线 * R>"NLS"拟合趋势线，数据检索来自标准ST文库（n=97） > 趋势线为幂函数y=a\times x^b > > * x为甾醇的前体m/z值 > * y为甾醇的前体CCS值 > * 实验起点为a=1，b=0.05 > > 拟合出甾醇趋势线为y=22.2x^{0.38}；R=0.7149——Fig. 4g > * 用预测区间为99%的趋势线构建化学空间，0.99PI由式5计算 $$ \Delta y(0.99PI)=Z\cdot S_{y,x}\cdot\left(1+\dfrac{1}{n}+\dfrac{(x-\bar{x})^2}{SS_x}\right)^{1/2}\tag{5} $$ > * Z = 2.576，是基于99%区间百分比的标准偏差Z分数 > * n = 97，数据量 > * S_{y,x} = 17.94513，x，y数据输入的标准误差 > * SS_x = 98.71926，x输入平均值的平方偏差之和 > ## 系统聚类分析 * 每个脑区的甾醇浓度首先被标准化为Z分数 * 使用带有默认参数的R包“pHeatmap”v1.0.12进行系统聚类分析 * 每组的平均值用于聚类计算，聚类方法为WPGMC（使用质心的加权对组法） ## 构建协同调控网络 * 从102中甾醇中筛选出幼年和老年小鼠至少一个脑区的失调甾醇，经检验具有统计学差异 * Pearson检验6周龄和68周龄102种失调的甾醇在各脑区的Fold Change * 保留77个甾醇和233个共调节对(220个正相关和3个负相关，|r|>0.85) * 使用Cytoscape，v3.7.2构建共调节网络 * 节点为失调的甾醇 * 颜色为10个脑区种每个区域的倍数变化的log2 - 最后修改：2021 年 09 月 17 日 © 允许规范转载 赞 如果觉得我的文章对你有用，请随意赞赏