Loading... # 脂质组学 - 脂质分类方法：结构单元化方法 - 整个脂质类别或者其中某一类脂质可以用一个通用的化学结构来表示 - 脂质组：细胞、器官或生物系统中化学性质不同的脂质的整个集合 - 脂质组学：基于分析化学的研究领域，广泛开展完整分子水平上的脂质组研究 # 质谱分析 - 质谱（MS）：通过研究单个分析物的质荷比（m/z）进行结构解析和定量的分析技术 ## 电离技术 - 分析物在质谱的离子源中被离子化，得到的离子送入质量分析器 - 使用最广泛的技术 - 电喷雾电离（ESI） - 基质辅助激光解吸/电离（MALDI） ### ESI - 原理 - 气相离子的形成 - 离子蒸发模型 - 电荷残留模型 - 激发组合残留带电场发射模型 - 源内分离：直接在离子源中分离脂质类别 - 快速、直接、可重复、可避免色谱分离中固有的干扰 - 源内分离广泛应用于生物样品中脂质提取物的分析，且有助于实现各类脂质的全分析 - ESI中，不同实验条件下不同类别的脂质分子其谱图不相同，但一个类别中的各个分子的离子强度比几乎一致。 > 一个类别中的各个分子的相应因子受脂肪链组成的影响非常小，因此一个类别中的各个脂质可用该类别中的一种内标通过离子强度比来定量分析 > 响应因子：单位质量(质量浓度)的杂质与API的检测信号响应之比(RFimp/RFapi) > - ESI的特点 - 分析物的分子离子被电离的过程中几乎不发生源内裂解 - 可获得较高的ESI-MS离子强度 - 有助于脂质的定量分析，碰撞诱导解离（CID）是一个依赖于分析物热力学的过程，而热力学又与分析物的结构有关 - ESI可研究脂质的相互作用与聚集现象 - 溶液中，脂质的溶剂加合物、二聚体及其它复合物的相互作用比较弱，ESI能检测到这些以非共价键结合形成的聚集体或复合物 - 脂质的聚集状态会对脂质的定量带来许多困难 - 通过改变离子源的条件以控制源内裂解是否发生 - 适应性强，适用的流速范围宽泛，对各种溶剂和改性剂包括酸、碱和缓冲溶液均适用 - 几乎所有的非挥发性脂质都能被离子化 - 中性脂质在离子源内易与小型阳离子和阴离子形成加合物 - 该过程可通过化学衍生化进一步加强 - 小离子与脂质的亲和力有助于加合物的产生 - 分析溶液和进样系统中的离子是加合物形成的另一个主要因素 - 对具有相似官能团和偶极矩的脂质，利用ESI-MS对比离子强度即可实现定量分析 - 极性头基含有基本相同的固有电荷性质 - 优点 - 可基于不同脂质的电荷特性，通过有选择性的电离一类或一种特定的脂质，离子源可作为分离设备，从而可在无需LC分离的情况下高效率分析不同的脂质和单个分子并减少离子抑制 > 离子抑制： > - 分析灵敏度高 - 可使检测限（LOD）由pmol/L降低到nmol/L > 检测限？ > - 可随仪器灵敏度的改善而进一步降低 - 低浓度下可避免脂质聚集 - 一个脂质类别中的各个分子均可通过比较其与该类别中的一种内标的离子强度来实现定量分析 - 根据总离子流色谱峰面积通过外标法建立标准曲线进行定量分析 > 在实验误差范围内去除13C同位素 > - 极性脂质的离子峰强度和其浓度之间的线性动态范围宽泛 - 取决于脂质在低浓度下的检测灵敏度和在高浓度下发生聚集时的浓度 - 对于没有大偶极子的脂质，需要预先确定各个分子的校正因子或校准曲线 - 也可通过衍生化来增强难电离脂质的离子化效率 - 直接进样法（鸟枪法脂质组学）重现性高 - ESI的进展 - 纳米电喷雾离子化（nano-ESI） - 离子化效率高、粒子流稳定、离子抑制小、样品用量少 - 离轴电场辅助喷雾设备 - 可从中性分子中分离离子，而且可完全去除溶剂，因此显著提高了离子化效率 - 在没有色谱分离的情况下，对生物脂质提取物的全分析具有重要意义 ### 基质辅助激光解吸/离子化（MALDI） - 步骤 - UV激光束诱导产生解吸 > 解吸：使被吸收或吸附的气体或溶质从吸收剂或吸附剂中放出来。用以获得纯净的气体或溶质，回收吸收剂或吸附剂。 > - 基质吸收激发过程的UV能量，导致基质上层（~1 μm）的消融 > 基质是什么 > - 消融过程产生的热羽流中包括 - 中性或离子化基质分子 - 质子化或去质子化机制分子 - 基质簇（设置是纳米液滴） > 基质簇 > - 分析物分子被离子化 - 机制尚不清楚 - 原理 - 通过添加质子或其它小型阳离子，或吸收激光能量后丢失质子以完成基质的电离。基质将电荷转移给分析物，即可检测到由中性分子[M]加和或丢失一个离子形成的准分子离子。 > 有机化合物分子受到电子轰击后,失去1～2个电子,这种带正电荷的离子称为分子离子，是比样品分子质量数多一或少一的分子离子，在质谱学上,如果准分子离子相对稳定，可得到M+1峰或M-1峰，这样可间接测得分子量。 > - 中性基质分子在将电荷转移到分析物之前不会首先被质子化和离子化，所以这一电离模型需要进一步改进。中性基质吸收激光的能量后呈碱性，因此可以消耗分析物中的质子，有助于形成准分子离子 - 早期MALDI离子源处于高真空环境中，后出现的AP-MALDI离子源可在大气压环境下工作，区别为前者通常在1.33Pa或更低的气压下 产生，而后者可在大气压下产生离子 - AP-MALDI的优点 - 是外部电离源，所以可较容易的与离子阱质谱仪或其它任何配有ESI或nano-ESI离子源的质谱系统相互替换使用 - 常压操作，可简单快速更换样品板 - AP-MALDI性能强大，如灵敏度高、质量检测范围宽、MS/MS多级扫描功能 > MS/MS多级扫描功能 > - 检测灵敏度相较于MALDI有限，但在离子转移上作了重要改进，显著提高了检测灵敏度 > 检测灵敏度与灵敏度？ > ## 质量分析器 - 离子源中产生的离子被传送到质量分析器后，质量分析器会根据它们的质荷比（m/z）将其分离 - 傅里叶变换离子回旋共振（FTICR）质量精确度和分辨率高 - 常用四极杆（Q）、飞行时间（TOF）、离子阱等 ### 四极杆质量分析器 - 原理：使用震荡电场来选择性的稳定或破坏离子通过四个平行杆产生的射频（RF）四极场的路径，只有m/z在一定范围内的离子才能一次性通过系统，但改变四极杆上的电压可以对较宽范围的m/z进行连续或分段的快速扫描 > 超过此范围的离子打在哪去了？ > - 三重四极杆（QqQ）质谱仪 - 串联三个四极杆 - 第一个四极杆为质量过滤器 - 将特定的离子传输到作为碰撞池的第二个四极杆 - 在第二个四极杆，离子与碰撞池中的氦气、氮气、氩气等惰性气体发生碰撞后裂解产生碎片离子 - 第三个四极杆也作为一个质量过滤器，依次将特定的碎片离子传输到检测器 - 可进行各种类型的串联质谱（MS-MS）扫描 - 优点 - 质量分辨率：单位质量数或更高 > 质量分辨率：单位质量数或更高 > - 质量准确度：m/z 1000 时为0.01% > 质量准确度 > - 线性动态范围：$10^5$ - 扫描速度：~s - 效率（传输*占空比）：<1%（扫描）至95% - 与电离技术兼容：AP/真空（连续） - MS/MS：碰撞诱导解离（CID），能量为eV - 成本：低到中等 - 尺寸/重量：台式 - QqQ型质谱仪是脂质组学常用的仪器，可通过选择性/多重反应检测（SRM/MRM）、中性丢失扫描（NLS）、前体离子扫描（PIS）、产物离子分析等方法实现定性定量分析，高选择性、宽线性动态范围，但质量精度和分辨率较低，通常只能实现对离子的二级串联质谱扫描，通过诱导源内裂解等方式实现串联质谱的三级扫描 > 选择性/多重反应检测（SRM/MRM）、中性丢失扫描（NLS）、前体离子扫描（PIS）、产物离子分析 > ### 飞行时间质量分析器 - 简介：利用电场加速以相同电势飞过漂移管的离子，然后测定它们到达检测器所用的时间 - 原理： - 质量为$m$的分析物，带有电荷数$z$，其动能等于电场中的势能，为 $$ mv^2/2=zeV \tag{1} $$ $$ - 其中$e$为电子的电荷，$v$为离子通过漂移管的速度。速度为 $$ v=d/t \tag{2} $$ - 其中$d$为漂移管的长度，$t$为离子通过漂移管到达探测器的时间。综上 $$ m/z=2eV(t/d)^2 \tag{3} $$ - 因此分析物的质量由其飞行时间推到，质量大的离子较质量小的离子到达检测器的时间长 $$ - 优点 - 质量分辨率：$10^4$ - 质量准确度：0.0002%~0.005% - 线性动态范围：$10^5$ - 扫描速度：$10^{-3}$s - 效率（传输*占空比）：1%~95% - 与电离技术兼容：AP/真空（连续/脉冲） - MS/MS：碰撞诱导解离（CID），能量为eV或keV - 成本：从低到高 - 尺寸/重量：台式或落地式 - 仅有TOF质量分析仪的质谱在利用MS/MS进行脂质分析时存在一定困难，需要使用四极杆-飞行时间串联质谱（QqTOF）或线性离子阱-飞行时间串联质谱（LIT-TOF）等混合质谱仪 - 混合质谱仪QqTOF在测定产物离子时具有良好的质量准确度和分辨率，而QqLIT除了可进行NLS和PIS分析外，还可进行多级质谱扫描（MS$^n$)分析 - QqTOF不能进行虚拟NLS和PIL分析，但可从产物离子分析数据阵列中提取类似NLS和PIS的数据 ### 离子阱质量分析器 - 简介：三维离子阱与QqQ原理相同，主要是通过射频场在一个环电极和两个呈双曲面形的端盖电极组成的分析器内捕获并依次喷射离子。线性四极杆离子阱与三维离子阱类似，但其在二维空间内捕获离子 > Orbitrap中的离子因静电作用而被捕获到围绕中心纺锤形电极的轨道上，电极限制离子的运动，使它们围绕中心电极轨道运动，并沿着中心电极的长轴来回震荡。该震荡产生图像电流，其频率取决于离子的质荷比。记录的图像电流经过傅里叶变换得到质谱图 > - 优点 - 质量分辨率：单位质量数（unit） - 质量准确度：0.01% - 线性动态范围：$10^2$~$10^5$ - 扫描速度：~s - 效率（传输*占空比）：<1%（扫描）至95% - 与电离技术兼容：AP/真空（连续/脉冲） - MS/MS：碰撞诱导解离（CID），能量为eV，能够进行多级质谱（MS$^n$）扫描，三分之一效应 - 成本：低 - 尺寸/重量：台式 - 检测灵敏度高，可进行高通量分析，且可实现多级串联质谱分析 - 质量分辨率低，动态范围窄，且存在空间电荷效应，无法实现非常精确的质量测定或定量分析。 - LIT-Orbitrap或Qq-Orbitrap等混合质谱的优点 - 质量分辨率：$10^4$~$10^5$ - 质量准确度：0.0001%~0.0005% - m/z范围：4000~6000 - 线性动态范围：$10^2$~$10^5$ - 扫描速度：约0.1s - 效率（传输*占空比）：1%~95% - 与电离技术兼容：API - MS/MS：eV，能够进行多级质谱（MS$^n$）扫描， - 成本：适中到高 - 尺寸/重量：台式或落地式 ## 检测器 - 质谱仪的最后一个组成部分，记录离子经过或撞击表面时的感应电荷或产生的电流 ### 电子倍增器 - 通常特定时刻导入到检测器的离子数很少，所以摇获得有意义的信号，需要相当大的放大倍数 - 离散电子倍增器、连续打拿极电子倍增器、微通道倍增板等 - 现代通常使用微通道板检测器 - 一个用于检测离子和撞击辐射的平面元件 - 由于微通道板检测器有许多独立的通道，所以它可以提供空间分辨率 ### 检测器 - 法拉第杯、闪烁广电倍增器、戴利倍增器等 - 常用检测器的比较 - | 检测器类型 | 优点 | 缺点 | | --------------------------------------------------------- | ---------------------------------------------------- | ------------------------------------------------ | | 法拉第杯 | 耐用、灵敏度稳定、适合测量离子透过率 | 放大倍数较低（~10） | | 闪烁光电倍增器 | 极耐用，使用寿命长（大于5年），灵敏度高（~$10^6$） | 对光敏感 | | 电子倍增器（EM） | 响应快，灵敏度高 | 使用寿命短（1~2年） | | 高能电子倍增器w/EM | 对于质量大的物质具有较高灵敏度 | 可能折损电子倍增器的寿命 | | 阵列检测器 | 响应快，灵敏度高，能同步进行测定 | 分辨率低（~0.2u）、昂贵、使用寿命短（小于1年） | | 傅里叶变换离子回旋共振质谱仪（轨道阱）FT-MS（Orbitrap） | 质量分析器可作为高分辨率的检测器 | 仅用于特定仪器 | ## 串联质谱技术 - ESI/MALDI等软电离技术的优势之一：不产生源内裂解 - 在适当的实验条件下仅产生极小的源内裂解，如果使用得当，源内裂解碎片也可以提供结构信息，但即使与色谱结合（LC-MS）也通常会有多种脂质分子同时进入离子源并被裂解，使脂质分析复杂化。 > 软离子源 > - 采用软离子源的质谱仪进行脂质鉴别和表征时，很大程度上依赖串联质谱分析 - 配备多个质量分析器或离子阱 - 常用的串联质谱模式为以下四种，其原理和QqQ类似[（参考）](http://www.360doc.com/content/20/0513/11/44802240_912045743.shtml) - 产物离子分析 - 中性丢失扫描（NLS） - 前体离子扫描（PIS） - 选择反应监测（SRM） - | 模式 | 质量分析器1 | 质量分析器2 | 应用 | | :------------: | :-----------: | :-----------: | :------------------------------------------: | | 产物离子分析 | 选择 | 扫描 | 获取前体离子的结构信息 | | 前体离子扫描 | 扫描 | 选择 | 检测碰撞诱导解离后产生相同碎片离子的分析物 | | 中性丢失扫描 | 扫描 | 扫描 | 检测碰撞诱导解离后丢失共同中性片段的分析物 | | 选择反应监测 | 选择 | 选择 | 检测特定的碰撞诱导解离反应 | ### 产物离子分析 - 步骤 - 第一级质量分析器仅传输特定的离子，用于选择特定的前体离子$m_x$ - 所选离子经电势作用加速后动能升高，在碰撞池中与惰性气体碰撞后，诱发碰撞加热，并产生碎片离子，包括 - 带有电荷的离子碎片，即产物离子 - 不带电荷的中性碎片，代表前体离子和特定产物离子之间的质量差 - 用第二级质量分析器检测得到产物离子$p_1、p_2、p_3$等的质荷比 - 根据产物离子重组和裂解规律并结合前体离子的质量来解析前体离子的结构  - 应用 - 用于表征离子的裂解途径和分析离散分子离子的裂解动力学 - 可依次对产生的产物离子进行多级串联质谱扫描（MS$^n$），获得化合物分子结构的关键信息 ### 中性丢失扫描 - 步骤 - 第一级质量分析器连续传输特定离子如$m_x$ - 该离子在碰撞池中CID - 第二级质量分析器监测质量数为$m_x-a$的碎片离子 - 前体离子经CID后产生产物离子$p_x=m_x-a$，质谱仪仅记录前体离子$m_x$  - 主要通过QqQ质谱完成，且广泛应用于鸟枪法脂质组学，以检测具有相同中性丢失碎片的一类或一组脂质，这些碎片通常来自于一类或一组脂质特有的头基 ### 前体离子扫描  - 步骤 - 第一级质量分析器每次连续输出个特定的离子 - 离子发生CID - 第二级质量分析器只监测特定的碎片离子$p_x$ - 所有在CID之后可以产生特定产物离子$p_x$的前体离子$m_1$、$m_2$、$m_3$都被记录 - 可通过QqQ质谱或把四极杆作为第一级质量分析器的许多其他混合型的质谱仪来实现 - 广泛应用于鸟枪法脂质组学，以有效监测CID后产生特定产物离子的一类或一组脂质 - 即通过监测产物离子和监测之前的m/z的时间相关性，确定哪个m/z前体离子可能产生所选产物离子 ### 选择反应监测  - 步骤 - 第一级质量分析器选择性的传输特定离子$m_x$ - 离子发生CID - 第二级质量分析器只监测一个特定的碎片离子$p_x$ - 主要有QqQ质谱完成，$Q_1$分离前体离子，q为碰撞池，$Q_2$监测特定产物离子 - 子母离子对：前体/产物离子对 - 监测特定的子母离子对，高特异性，高灵敏度 - 多反应监测，MRM：第一级或第二级或两者都被设置为监测多个离子以实现多个离子对的监测 - SRM是其他三种MS/MS技术的特例 - LC-MS联用时，SRM/MRM技术被广泛应用于脂质组学定量分析单个脂质分子 ### 应用 - 前3类扫描模式常用于方法开发：识别感兴趣分子的前体m/Q (全扫描)，确定其裂解的m/Q(产物离子扫描)，确认在样品中只有感兴趣分子产生m/Q产物离子(前体离子扫描)。 - 在大多数情况下，一般会选择SRM。 - 对于特定应用，在寻找常见代谢物或相关化合物时，可使用中性丢失扫描，但临床上90%以上会选择SRM。 ### 串联质谱技术 简化模型 > 每一种分子离子具有不同的m/z，经CID，在产物离子分析模式中产生不同的质谱 > > 这些分子离子属于同一类脂质，因此具有几乎相同的质谱裂解规律。 > 假设：分子离子裂解后产生三种特征的产物离子 - 分子离子为$m_1$、$m_2$、$m_3$，产生质量为$a$的共同中性碎片丢失的产物离子 - 于此同时，分别产生产物离子$p_{1a}$、$p_{2a}$、$p_{3a}$，$a$为两者之差 - 分子离子为$m_1$、$m_2$、$m_3$，产生共同的产物离子$p_c$ - $p_{1c}=p_{2c}=p_{3c}$ > 这两个特征来自于经CID后产物离子分析中的各类甘油磷脂的头部集团 > - 每个分子离子从共有部分，如脂肪酰基链，产生特定的碎片离子。 - 该特定的碎片离子导致分子离子$m_1$、$m_2$、$m_3$分别产生一系列产物离子$p_{1b}$、$p_{2b}$、$p_{3b}$ - 通过CID后的产物离子分析，结合碎片离子与每种分子离子的m/z推断每个脂质分子的结构和骨架 > 示意图解读 > 简化模型分析 ## 其他质谱技术 ### 离子淌度质谱（IM-MS） - IM-MS是一种基于载气缓冲气体中离子化分子的迁移率的差异来分离气相中离子化分子的分离技术 - 离子迁移率与离子的差分电压、离子质量、电荷、尺寸、形状有关 > 离子的碰撞截面：气体分子撞击离子的面积，与离子的大小、形状直接相关，可用来判断离子的质量和结构 - IM-MS可对包括结构异构体在内的复杂脂质混合物进行快速分析，并对脂质进行快速二维分析 ### 解吸电喷雾电离  - ESI和解吸电离DI的结合 - DESI中分析物的电离通过向样品高速喷射由ESI产生的带电雾滴实现，而不是用激光或主离子束 - 步骤 - 雾化溶剂在施加高压后，由雾化器的内套管喷出，外套管喷出高速气流，通常为氮气 - 高速气流使电喷雾产生的带电液滴迅速雾化并得到加速，碰撞到样品表面，使分析物发生化学溅射而从载体上解吸并发送电离 - 同时氮气的扫吹作用使含有分析物的带电液滴发生去溶剂化，产生的气态离子通过传输通道进入质谱 - 适用于 - 大分子化合物 - 小分子化合物 - 通过溶剂离子与分析物分子间的电荷（质子或电子）转移而实现的 - 电荷转移包括 - 溶液相溶剂离子与固相分析物在样品表面发生 - 气相溶剂离子与固相分析物在样品表面发生 - 气相溶剂离子与气相分析物在样品表面发生，在样品具有较高蒸气压时发生 - 影响DESI离子化效率的原因 - 样品的表面性质 - 电喷雾参数 - 喷雾溶剂组成 - 几何参数 - 优点 - 不需要或只需要简单样品前处理 - 不需要添加基质 - 离子化过程在大气压环境下实现 - 脂质容易电离 - 应用 - 生物样品如组织中磷脂、脂肪酸等可电离脂质分子的直接分析和质谱成像分析 # 基于质谱的脂质组学 > 介绍基于ESI和MALDI的脂质组学方法 - 根据进入离子室的脂质溶液是否处于**恒定浓度**，基于ESI-MS的脂质组学方法可分为两类 - 鸟枪法脂质组学：恒定 - 基于LC-MS的脂质组学：进入离子源的脂质溶液浓度不断变化 ## 鸟枪法脂质组学 ### 直接进样装置 #### 常用注射器泵 - 成本低 - 进样量可低至每分钟几微升 > 通常进样溶液流速越高，越有利于脂质组学分析，高品质的密封玻璃注射器泵可达到 - 缺点 - 难以实现脂质分析的自动化 - 进样毛细管易堵塞 - 维持高流量的样品消耗量也相对较大 #### 硅基纳米电喷射微芯片装置（NanoMate装置） - 利用一个由400个纳米电喷射发射器组成的ESI芯片，可控制流速为100 nL/min - 可实现自动化进样 - 大大减少样品堵塞 - 减少样品量和交叉污染 > 5~10 μL样品可实现约1 h的持续稳定喷雾，保证了极小量样品的多次重复测量、高准确度和高重复性 > - 缺点 - 成本高 - 长时间自动分析过程中，会造成微量脂质样品的溶剂蒸发 > 弱挥发性溶剂（如异丙醇）有助于改善溶剂保存、脂质溶解度和离子化效率 > > 铝箔密封样板或低温保存样品板，可有效减少样品溶剂损失（-20℃下可保存4周） > #### 定量环进样 - 定量环不能持续维持恒定的脂质浓度 - LC分离后收集到的单个组分直接进样，可维持样品溶液浓度恒定 ### 鸟枪法脂质组学的特点 - 原理： - 最大限度地利用各类脂质和各个脂质分子的化学和物理特性，以便于大规模地直接从生物样品的有机提取物中对细胞脂质组进行高通量分析 - 其原理决定了只能在恒定浓度的溶液中进行脂质的ESI-MS分析 - 鸟枪法脂质组学的优点 - 在恒定浓度条件下，维持脂质之间的恒定相互作用，因此各个脂质在ESI源中的离子流是恒定的，从而使一类脂质中的各个分子之间的的离子峰强度的比率恒定 - 一类脂质中的各个分子之间以及不同类被的脂质分子之间的离子抑制是恒定的 - 有效地将脂质聚集控制到最低水平 > 脂质聚集： > > 是影响脂质定量的重要因素 > - 特点 - 由足够的时间来提高质谱S/N，从而根据PIS、NLS等技术绘制详细的MS/MS图谱并进行多级MS/MS分析 - 单次进样过程中保持溶剂与分析物比例恒定，改变仪器参数（碰撞能量、碰撞气压、气体类型、离子迁移参数等）可避免色谱洗脱时“在线”分析过程中的时间限制 > 时间限制 > - 一类脂质中的各个分子离子均可以显示在一个完整的质谱图中，通过与内标的比较，可以实现各个脂质分子的定性和定量 - 极性头基的电荷性质决定其源内裂解和选择性电离，因此极性脂质的响应因子基本相同 - 因此直接在同一张质谱图中比较各个离子峰的强度与内标的强度，即可实现一类极性脂质中各个分子的定量 ### 鸟枪法脂质组学 主要包括三种 #### 串联质谱鸟枪法脂质组学 - 原理 - 不同类型的脂质通常具有与其头部基团相关联的特征质谱片段 - 方法 - 通过特定的NIS或PIS扫描来检测该特征片段对应的脂质分子 - 经过MS/MS双重过滤后，质谱S/N比可以大大提高（通常超过一个数量级） - 工作流程 - 该方法的工作流程参照文献[16] - Welti 等[17] 提供的方案综合列出了可用于检测各类脂质(特别是植物脂质组学)的特征片段 #### 高质量精度鸟枪法脂质组学 - 四极杆飞行时间质谱仪（Q-TOF）或四极杆轨道阱质谱仪（Q-Exactive）可有效增加灵敏度、分辨率和准确性 - 利用这仪器快速在小质量范围内逐渐进行子离子质谱分析，直到在整个质量范围内得到所有碎片 #### 多维质谱鸟枪法脂质组学（MDMS-SL） - 利用不同类别或亚类脂质固有的独特化学性质来分析脂质 - 根据不同类别和亚类的脂质分子之间疏水性和稳定性的差异处理样品 - 磷酸乙醇胺含有独特的伯氨基官能团，因此可以利用芴甲氧羰酰氯来标记细胞脂质组中含磷酸乙醇胺的脂质。这些标记的脂质分子很容易丢失Fmoc基团，因此可以轻易地在amol/μL浓度水平上实现对这类脂质的定性和定量，灵敏度极高。 > Fmoc基团：笏甲氧羰基，胺基保护基[（参考）](https://zhidao.baidu.com/question/1802739294174056827.html) > ### 优缺点 #### 串联质谱鸟枪法脂质组学 - 优点 - 简单、高效、灵敏度高、易于管理、仪器设备成本低 - 不足 - 脂肪酰基难以识别 - 不易识别实验过程中和实验结束后电离条件的改变 - 不同类别的脂质裂解机制不同，精确定量目标脂质并不简单 - 特定的MS/MS扫描可能不适用于目标类别的脂质 - 内标 - 至少两个可覆盖目标脂质类别中各个分子差异的代表脂质以精确定量 #### 高质量精度鸟枪法脂质组学 - 优点 - 高效、广泛、灵敏 - 考虑 - 本质为基于串联质谱，内标应至少两个 - 非极性脂质中不同脂质的电离响应不同，因此对这些脂质进行定量时应该对不同的离子化响应进行校正。 - 线性动态范围的定量很大程度上取决于分析碎片离子的仪器。由于存在异构重叠现象，低丰度的碎片离子常受到高丰度的碎片离子的影响，或者在选定的质量范围内存在多种碎片形式。 - 还应考虑同位素碎片在选定质量范围内的影响。 #### 多维质谱的鸟枪法脂质组学 - 优点。 - 直接从生物提取物中定性和定量各种脂质,其中质谱仪除了作为分析仪之外还用作分离装置，从而避免了对色谱的依赖。 - 与LC-MS方法相比，通过对无限时间帧的信号进行平均，可以大幅增加S/N。 - 不需要预先了解任何与生物提取物中的脂质有关的信息，在各种质谱条件下（即MDMS），使用PIS和/或NLS对脂质的结构单元进行原位分析和鉴定。 - 使用多维空间中的峰等高线，通过两步定量法(详见第15章)结合质量偏差和同位素分析以生物信息学的方式进行校正，有利于促进定量精准化。 - 合理地利用各类脂质的化学特性。例如,使用[M- -2H+1]$^{2-}$同位素体分析CL，使用Fmoc衍生化分析含磷酸乙醇胺的脂质，在动态脂质组学中使用特异性氘代胺选择性试剂对特定成分进行PIS分析，使用碱性水解有助于鞘脂的分析，以及使用远电荷碎裂进行脂肪酸组学分析(4)等。 - 局限 - 对于含量极低的脂质而言，目前的质谱仪普遍存在离子抑制现象，因此鸟枪法脂质组学灵敏度不高，必须要进行一定的富集。 一般情况下，鸟枪法脂质组学不适用于低含量或电离难度大脂质的分析。但是，这类脂质经过衍生化后可以通过MDMS鸟枪法脂质组学中进行检测。此外，基于MDMS的鸟枪法脂质组学同样适用于经过分离的样品。因此， 色谱分离、液-液分配、固相萃取和其他富集方法,对于提高低含量脂质的检测限非常有利。 > 离子抑制现象：内标的信号减弱。存在干扰物，在离子化的过程中，与待检测物和内标争抢离子，使得待检测物与内标的离子化不完全。离子抑制可重复。通常通过稀释以解决。 > > [（参考）](http://www.clinicalms.com.cn/learn_show/136.aspx) > > CV：补偿电压，电极之间的直流电偏压，用于补偿给定离子向其中一个电极漂移的倾向 > > DV：分散电压，施加在FAIMS电极上的高频不对称波形的峰电压 > > [（参考）](https://www.docin.com/p-975204601.html) > > %CV，Coefficient of Variation，变异系数。用以比较两组数据离散程度的大小，消除测量尺度和量纲 > - 当脂质同分异构体的碎裂模式相同时，无法对其进行区分。 - 对于未知脂质，该方法的定性和定量效果并不理想，必须预先确定脂质的结构单元。与其他两种鸟枪法脂质组学方法相比,其工作效率相对较低。 ## 基于LC-MS的脂质组学方法 ### 概述 - 基本原理 - 最大限度地利用LC分离技术以及MS高灵敏度的检测能力 - 三要素 - 合适的色谱柱，优化分离条件 - 色谱柱：正相、反相、亲水相互作用、离子交换、亲和层析色谱柱、多维LC - 流动相 - 梯度 - 考虑LC洗脱条件与质谱仪的适当连用 - HPLC与质谱联用时，流动相中的离子强度不能太高 - 离子抑制对离子化效率的影响随离子浓度特别是无机离子浓度的增加变得严重 - 在流动相中引入离子 - 如在正相LC中引入电离改性剂以促进加合物形成 - 在反相色谱中采用离子梯度 - 低离子强度或挥发性酸或盐优于非挥发性化合物 - LC流速 - 合适的MS参数以尽可能多的定性和定量洗脱各个脂质分子，洗脱液中的脂质浓度不断变化，脂质的鉴定和定量必须在非常的时间内进行，同鸟枪法脂质组学相反。 #### 用于LC-MS的选择离子监测（SIM） - 使用SIM完成LC-MS的全脂质分析，可以从总离子色谱中提取任何目标离子，并检测出全部具有相同分子质量的脂质 - 局限性 - 普遍应用于少量脂质的针对性分析，而不适用于大规模脂质定量 - 不一定明确鉴定各个提取离子 - SIM中存在多种干扰 #### 用于LC-MS的选择/多反应监测 - SRM/MRM是检测特定离子的首选方法，耗时短 - LC分离后不存在干扰，则检测的碎片离子对前体是特异性的 - 局限性 - 需预先确定各个脂质的洗脱时间，除了对限定离子对的时间外，不适用与分析没有预先确定洗脱时间的脂质 - 只能确定包含限定离子对的脂质 #### LC-MS数据分析 - 无论使用哪种类型的色谱柱，一类脂质中的各个分子或多或少会在不同时间洗脱出来 - 正相色谱：含饱和脂肪酰基取代基的脂质通常比含又不饱和脂肪酰基取代基的脂质提前洗脱 - 反相色谱：氘代标记的同位素异构体也可以与未标记的脂质分离开 - 单次洗脱后，对已知m/z的分子离子进行产物离子分析 ### 基于LC-MS的脂质组学方法 #### 正相LC-MS - 通常正相LC中固定相为未改性的亲水$SiO_2$颗粒，游离的硅烷醇集团发挥作用 > 正相色谱：亲水性固定相，疏水性流动相，即流动相极性小于固定相极性；升极性洗脱，极性小先出峰 > - 也可使用各种有机官能团修饰的硅烷醇集团 - 二醇、腈、硝基、甲基氰基、苯基氰基等通过化学键键合至表面，使得分离更有效，改善拖尾，且平衡时间短 - 根据脂质分子中极性官能团的数量和性质来分离组分 - 极性头基决定了其与固定相的极性相互作用，色谱通常将脂质分为不同类别，而不是单个分子 - 通常溶剂体系为氯仿+甲醇和正己烷+异丙醇，比较适用于ESI离子源，无机盐与MS不相容，少量有机盐或酸可用作改性剂 - 等度洗脱可分离特定的脂质，但梯度洗脱的通用性更强 #### 反相LC-MS - 通常反相色谱对脂质的分离基于脂肪酰基链的疏水性，而并非脂质头基的极性，因此反相色谱仅适用于特定类别的脂质，而不适用与所有的脂质提取物。 > 因此不同种类但具有相同m/z的脂质可能具有相似的疏水性，因此会使脂质混合物的数据解析和定量变得复杂 > - 固定相 - 非极性固定相 - 十八烷基甲硅烷基（C18或ODS） - 长链碳氢化合物以共价键的形式结合在粒径3~10μm颗粒表面 - 流动相 - 通常为乙腈或甲醇 - 可有改性剂，有机盐、有机酸或组合 - pH为2~9 > 强酸强碱下，键合的长烷基链会水解 > - UPLC - 通过缩小粒径来提高色谱分辨率 - 通常用于全脂质分析 - 反相色谱后通常关联MRM，UPLC后通常关联SIM #### 亲水作用LC-MS - 亲水作用液相色谱（HILIC），亲水固定相，反相洗脱液 > 正相萃取就是极性萃取,目标物是带有极性官能团（氨基、羟基、杂原子等）的化合物，用极性吸附剂从非极性溶剂（正己烷、油、氯仿）或中极性有机溶剂中萃取. > 反相萃取就是非极性萃取,目标物是带有非极性官能团（芳香环、脂肪链）的化合物，均可使用非极性吸附剂（C18、C8、PH、CH、CH-E）从极性溶液（水、缓冲液）中进行萃取。 > - 固定相 - 任何极性色谱表面都可，即便是非极性键合硅胶 - 流动相 - 含有少量水的乙腈 - 任何可与水互溶的非质子溶剂，四氢呋喃或二恶烷 - 高浓度的醇 - 可使用离子添加剂如乙酸铵、甲酸铵作为改性剂控制流动相pH和离子强度 - 分离机制 - 流动相在极性固定相表面与非水流动相表面形成了富水层，形成液/液萃取系统 - 分析物在两层之间，极性大的化合物与固定相水层的相互作用更强 - 适用于全脂质组学 #### 其它LC-MS方法 - [银离子或银盐色谱](https://cn.chem-station.com/化学杂记/实验技巧/2017/09/银离子附载的层析色谱.html) - 银盐预处理硅胶，主要用于分离含有不饱和键的有机化合物 - 原理 - 银离子与碳-碳双键螯合 - 双键等不饱和键数量越多，作用越强，且Z体强于E体 > 分别比较每个碳原子上连接的两个原子或基团，若两个较优基团在π键平面同侧者为Z型异构体，在异侧者为E型异构体。 > - 非共轭的双键更强，双键离得远的相互作用强 - 存在羧酸、羧酸酯，不饱和键离羰基近则更强 - 相互作用越强，在硅胶上滞留时间越久，即Rf值越小 - 优势 - 可以分离酸性硅胶TLC很难分离的EZ异构体 - 不仅仅TLC，还可应用于硅胶色谱柱 - 使用者多，分离条件易查询 - 缺点 - 银 - 手性色谱法 - 拆分花生酸的手性异构体以及甘油二酯和甘油单酰的对映异构体 - 离子交换色谱 - 分离不同类别的脂质 - 由于流动相离子强度较高，不能直接链接质谱仪，但离子交换固相萃取柱可以用于脂质分离，然后采用反相LC-MS或鸟枪法脂质组学对特定脂质进行分析 ### 优缺点 - 优点 - 发现和鉴定新型脂质特别是含量非常低调脂质分子方面应用广泛 - 简化了脂质分离步骤 - 如正相色谱可分离出单独一类脂质 - 反相色谱根据脂质疏水性不同分离脂质 - 组合不同类型的色谱柱以在线或离线的方式实现二维或多维分离 - 问题 - LC中，通常在不同的洗脱时间测定分析物的离子化效率，为流动相组成的不同又会对离子化效率产生影响 > 为何需要在不同洗脱时间测定分析物的离子化效率 > - 正相色谱中，某一类脂质种的各个脂质分子并不是均匀分布在洗脱峰中，各个分子保留时间和峰形各不相同，因为其与固定相及所用离子对试剂的相互作用不同 - 通常利用反相色谱结合梯度洗脱来分离各种脂质，流动相组分的变化可能导致电离不稳定性增加，还可能影响不同流动相洗脱时脂质的离子化效率 - 反相色谱的梯度洗脱通常采用水相开始洗脱，可能导致一些溶解性的问题，因为反相HPLC通常将样品浓缩至水相中的溶解度极限，会导致脂质分子发生聚集和离子化效率差异 - 脂质在色谱柱上的损失存在差异 - 串联质谱SRM/MRM中，不同分子的响应因子不同，应根据不同脂质类别中的脂质分子的多样性来选择多种内标 ### LC-MS分离后脂质的鉴定 - 通过产物离子MS分析匹配各类脂质的独特碎裂模式，从而确定色谱柱上洗脱出来 的各个分子 - 重要信息 - 数据库 - 包含脂质在不同电离模式下的结构、相对分子质量、同位素和MS/MS谱图等信息 - 脂质在LC中可能的保留时间 ## 脂质组学中的MALDI-MS ### 概述 - 可以分析几乎所有类型的脂质，并且适用于氧化脂质和生物脂质提取物的研究。 - 正离子模式：大多数脂质呈现[M+H]$^+$、[M+Na]$^+$、[M+K]$^+$或其它正离子形式 > 稳定的季铵基团导致PC的灵敏度高 > - 负离子模式：通常[M-H]$^-$离子占优 > 源后裂解较正离子模式严重，且脂肪酰羧酸盐通常以基峰存在，导致酸性GPL（如磷脂酰乙醇胺）的分析相对困难且灵敏度降低，因此可采用HPLC或TLC分离不同类型的脂质，再在正负离子模式下分析各类脂质中的分子 > ### 脂质提取物的分析 - PC和SM的正离子MALDI-MS分析通常显示两个准分子离子 - 分别对应 - 质子化形式 - 钠加合物 - 离子峰的强度比取决于基质中钠的含量 - GPL（甘油磷脂）的质子加合物在m/z 184处产生独特的片段，对应磷酸胆碱 - 含有磷酸胆碱的脂质可以产生强烈的正离子信号，但这些分子在负离子模式下的解吸/电离非常差 > 为什么非常差 > - PE（磷脂酰乙醇胺）的正离子MALDI质谱 - 丢失磷酸乙醇胺头基后会产生一个特定的碎片离子 - 也可在负离子模式电离，但灵敏度较低，质谱通常以PE的基质加合物为主 - PS（磷脂酰丝氨酸） - 阳离子质谱有 - 质子化 - 钠离子化 - 对应于[M-H+2Na]$^+$的离子峰 - 丢失磷酸丝氨酸头基产生的碎片离子 - 表明极性头基的裂解是GPL裂解的主要途径 - 负离子质谱 - 基峰为[M-H]$^-$ - 其它强度较高的离子峰为分子离子峰[M+Na-2H]$^-$ - 基质加合物 - 非极性脂质如胆固醇和TAG - TAG的正离子质谱中仅有钠离子加合物 - 由于源后裂解，TAG的MALDI质谱中会出现丢失脂肪酰酸钠而形成的离子 ### 优缺点 - 优势 - 分析速度快，单样品测定时间不超过1min - 易操作，只需点样到板上 - 灵敏度较高，样品用量仅为皮摩尔级别 - 已点样的脂质样品通常可做重复测定 - 已实现从点样到数据采集的全自动化 - 缺点 - 电离基质化合物，导致低m/z区域的脂质分析更复杂，例如源后裂解产生并用于脂质结构表征的碎片 > 源后裂解 > > A post-source decay (PSD) is a process specific to the ion source utilizing matrix-assisted laser desorption/ionization and operating in vacuum. In the post-source decay, parent ions (typically of several keV kinetic energy) fragment in a process of laser-induced fragmentation or high-energy collision-induced dissociation (HE CID). > Time interval suitable for observation of the post-source decay in the reflectron starts after the precursors (parent ions) leave the ion source and ends prior to the moment when the precursors enter the ion mirror.[17] The kinetic energy of fragment ions of mass m in the post-source decay significantly differs from that of parent ions of mass M and is proportional to m/M. > So, the distribution of kinetic energies for the PSD ions is extremely large. Not surprisingly, it cannot be compensated in "classic" single or double-stage reflectrons. To achieve acceptable mass resolution for PSD ions with masses typically distributed over broad mass range, these ions are accelerated to energies substantially (at least, a factor of 4 [18]) exceeding the initial energy of precursor ions. Use of gridless curved-field mirror or that with time-dependent field also improves the mass resolution for fragment ions generated in the post-source decay. > - 源后裂解有助于脂质结构的鉴定，但由于不同的脂质的裂解动力学存在差异，因此会导致定量困难 - 各种脂质加合物和离子化形式的存在，使质谱分析更复杂，降低定性和定量分析的灵敏度 - 结晶过程会发生脂质聚集，导致脂质在样品点中的分布不均匀 - 难以精确定量 - 主要应用于快速筛查样本中的脂质类型 ### MALDI-MS的研究进展 #### 使用新型基质 #### （HP）TLC-MALDI-MS #### 无基质激光解吸/电离方法 # 质谱技术在脂质组学应用中的变量因素 ## 脂质提取过程中的变量因素 ### pH - pH决定脂质分子的极性和电荷性质 - PE酸性条件下带正电荷，碱性条件带负电 - 还包括那些带磷酸、硫酸或者羧酸基团的酸性脂质分子 - pH>5，这些分子至少带一个单位的负电荷，酸性更强的条件下为电中性 - pH改变会导致脂质分子的极性和电荷改变，影响脂质提取过程中的回收率，离子化效率和离子形成的类型 - 酸性有利于酸性脂质分子（如PA）的提取 - 中性下适合PE的提取 - 总脂提取需要在弱酸性条件下进行 ### 溶剂极性 - 非极性脂质（TAG、胆固醇和胆固醇酯以及游离脂肪酸NEFA） - 常使用非极性溶剂如正己烷、乙醚提取 - Folch法，大部分脂质都可采用氯仿（或二氯甲烷）或甲基叔丁基醚（MTBE）提取 - 强极性脂质（如酰基辅酶A，酰基肉碱，溶血甘油磷脂，多磷酸磷脂酰肌醇，神经节苷脂） - 固相萃取柱，如反相或亲和，或特殊溶剂，从水相中回收 ### 脂质固有的化学性质 碱性条件下，含有鞘氨醇骨架或醚键连接的甘油酯比较稳定 - 可在碱性条件下分离和富集鞘脂和含醚的溶血脂质 - 所有通过酯键连接的甘油酯会水解 - 乙烯基醚连接的脂质分子，即缩醛磷脂，对酸性条件敏感 - 不同官能团的反应活性差异 - 分析伯胺基脂质，如PE、溶血磷脂酰乙醇胺 - 含有羟基的脂质分子，如氧化型胆固醇、DAG、MAG、花生四烯乙醇胺及其类似物，可以通过多种衍生化方法提高离子化效率 - N-（4-氨基甲基苯基）吡啶鎓或其它类似试剂与羧酸基团偶联形成酰胺键，可以灵敏地检测类花生酸，确定游离脂肪酸中双键的位置 - 4-羟基烯醛与肌肽的反应活性，可及时准确有效监测这些脂质的氧化中间体 - 缩醛磷脂和脂肪族链中乙烯基醚双键的反应活性 - 可以利用脂质在甲醇中经碘衍生化后产生的异构离子确定含有缩醛磷脂和含醚键的磷脂 ## 进样溶液 ### 溶剂极性、组成、离子对以及其它变量 > 大部分脂质难溶于极性溶剂，他们会随着浓度的增加而形成聚集体、胶束或囊泡，而处于聚集状态的脂质不能被有效和定量地电离 > > [](脂质聚集) - 在鸟枪法脂质组学和LC-MS两种方法中，可以通过梯度混合的方法实现两种溶剂组成的连续变化 - ESI-MS中，最常用的溶剂体系为氯仿（或二氯甲烷）和甲醇1:2~2:1(V/V)，异丙醇也可和氯仿和甲醇混合使用 - 鸟枪法脂质组学中可能需要添加改性剂（如有机酸、碱或盐） - LC-MS中的溶剂很大程度上由色谱模式决定 ## 改性剂的含量及组成 - 改性剂的化学和物理性质对脂质的电离灵敏度和效率以及分子离子峰都有显著影响 > 进样溶液的冗余离子 > - 改性剂对电中性脂质的影响较大 > 正离子模式下，PC通常被电离为阳离子加合物，在负离子模式下，被电离为阴离子加合物 > ### 酸性改性剂 - 正离子模式 - 酸性改性剂，如甲酸、乙酸，有利于脂质混合物中PC、SM和PE的质子化 - 不存在电中性脂质，如PC、SM或PE时，其它酸性脂质如PS、PI和PG在酸性条件下也可以在正离子模式下电离，但会被共存的电中性脂质抑制 - 负离子模式 - 电中性脂质电离后与改性剂的阴离子基团形成加合物，或与PC和SM类似，电离后生成去甲基离子化合物 - 电中性脂质电离产生的阴离子加合物的质谱图非常复杂，增加了阴离子脂质的同峰或同质异构离子被检测到的可能性，且很少通过加酸性改性剂的方法进行LC-MS分析 - 酸性脂质电离为去质子化形式 - 酸性条件下去质子化并不容易发生，因为酸性条件通常会抑制这些分子发生去质子化，且酸性越强越明显。 ### 中性改性剂，如乙酸铵、甲酸铵、氯化锂等 - 含磷酸胆碱的脂质，如PC、SM，在铵类改性剂或改性剂的阳离子加合物存在时发生质子化 - 非两性脂质分子，如HexCer、TAG、DAG在正离子模式下不形成或仅形成阳离子加合物 - 质子化TAG分子的鉴定是根据质量匹配进行的，无它法可证明 - 正离子模式下 - 阳离子脂质的电离效率比电中性脂质差，因此会被电中性脂质的阳离子加合物抑制 - 不存在PC、SM和PE或采用LC-MS分析的情况下，阴离子脂质仍可发生质子化或电离为阳离子加合物等形式。 - 含磷酸乙醇胺的脂质呈弱酸性，电离通常发生在含磷酸胆碱的脂质和阴离子脂质之间 - 负离子模式 - 电中性脂质电离产生的阴离子加合物的质谱图复杂，这种情况大大增加了阴离子脂质的同峰或同质异构离子被检测到的可能性 - 等摩尔混合物的分析，阴离子脂质的强度通常会大于含磷酸胆碱的脂质加合物的强度 - 对于脂质混合物的LC-MS分析，这种类型的改性剂有利于正离子模式下含磷酸胆碱脂质的检测，也有利于负离子模式下阴离子脂质的检测，因此这些类型的改性剂通常适用于所有色谱模式的LC-MS分析 ### 碱性改性剂，如LiOH、NH$_4$OH等 - 容液中以去质子化形式存在所有阴离子脂质，包括含磷酸乙醇胺的脂质，均不易在正离子模式下发生离子化，而负离子模式下离子化增强 - 含磷酸胆碱的脂质不容易与OH$^-$形成加合物 - 正离子模式 - 含磷酸胆碱的脂质易发生质子化或形成阳离子加合物 - - 负离子模式 - 阴离子脂质，包括含磷酸乙醇胺的脂质，需用碱性改性剂离子化，以去质子化的形式存在于溶液中。 > 强度比代表脂质的摩尔比，相比弱阴离子脂质，包括含磷酸乙醇胺的脂质 > ### 改性剂浓度 - 负离子模式下， - 增加LiOH浓度，PG对应的离子峰会降低。 - 因为加入LiOH后，PE转为阴离子模式，并且阴离子PE与阴离子GPL的离子化效率类似，加入其它碱性分子情况类似。 - 负离子ESI质谱还表明，进样溶液LiOH浓度增加，氯离子化的PC对应的离子峰会消失 - 该条件下，PE的选择性离子化和氢氧根离子存在时氯化物与PC结合律降低共同导致的结果。 - 氢氧根离子与PC的亲和力非常弱 - 正离子模式下分析GPL混合物 - 质谱图上的各个离子峰由PC的各种加合物组成，因此PC可以被选择性地离子化 - LiOH与质子发生了中和，导致质谱图上质子化离子峰的消失 - 增加LiOH后锂离子浓度增加导致锂化加合物的出现 - 在相对较高的LiOH浓度下，钠离子化的PC对应的峰液持续存在，表明体系中存在钠离子或钠离子与PC具有高亲和性或两种情况同时存在 - 不同实验条件下，不论是否存在会显著影响脂质分子离子峰的改性剂，各个脂质组分子离子峰之间的比值都不会受到影响 > 全质谱检测条件下，极性脂质组内分子的离子化效率（或响应因子）基本相同，脂肪酰基链对离子化效率的影响非常小 > > 因此可比较离子峰与内标的强度以定量极性脂质 > > 采用流动相梯度洗脱或不断改变洗脱液浓度时，会导致该类脂质分子间的响应因子发生变化 > - 鸟枪法脂质组学中，如需变化溶液中的改性剂或其浓度，可使用梯度混合器 ### 进样溶液中的脂质浓度 - 氯仿:甲醇（1:1，V/V）中，浓度大于0.1nmol/μL，酰基侧链的长度和不饱和度对离子化效率和响应因子的影响十分明显。 > 随着脂质浓度和溶剂极性的增加，脂质分子倾向于形成聚集体（二聚体，寡聚体，胶束甚至囊泡） > - 脂质聚集体的离子化十分复杂 - 聚集体大小不可预测，其大小由脂质浓度，组成和溶剂极性决定 - 脂质混合物的单个聚集体复杂且不可预测 - 通常疏水性强的脂质分子较疏水性弱的分子更易形成聚集体 - 和聚集体相关的小型离子加合物或去质子化的质子分子的数目复杂且不可预测 > 聚集体 > > - 会导致噪音水平升高 > - 降低单个分子的浓度而降低灵敏度 > - 低浓度范围（即pmol/μL或更低），绝对离子强度与每种极性脂质的浓度呈线性相关，这种线性关系需内标确定 - 以进样溶液作变量 - 有助于确定相同或不同的脂质是否形成聚集体 - 可从物理或化学的角度研究相同或不同脂质对质子、小基质阳离子或阴离子的竞争性 ## 离子化过程中的变量因素 ### 离子源温度 # 生物信息学在脂质组学中的应用 ## 脂质文库和数据库 ### 脂质代谢途经研究计划（Lipid MAPS）结构数据库 - [LIPID MAPS® Lipidomics Gateway](https://www.lipidmaps.org/data/structure/index.php) - 生物相关脂质的唯一命名系统，以支持自动化处理脂质组学数据 - 在线工具可绘制脂质结构，并通过质谱数据预测 - 构建虚拟数据库 - 包括 - 碳原子总数 - 双键总数 - 化学式 - 精确的单同位素质量 - 结构单元（即碎片） ### LipidBlast-电子串联质谱库 - [Fiehn Lab - LipidBlast (ucdavis.edu)](https://fiehnlab.ucdavis.edu/projects/lipidblast) - 计算机生成的产物离子模式下的串联质谱朴图的文库 - LipidBlast可与其它可用的搜索引擎和评分算法一起使用，可以成功应用于分析来自40多种不同质谱仪类型的串联质谱数据 ### METLIN数据库 - [METLIN](https://metlin.scripps.edu/landing_page.php?pgcontent=mainPage) - 是最全面的代谢物信息以及串联质谱数据存储库，基于MySQL - 每个代谢物通过KEGG、HMDB和CAS等数据库进行关联 - 在正离子和负离子模式下，通过（0、10、20、40eV）四种碰撞能量下获得的产物离子模式获得超过1w中不同代谢物的串联质谱数据和超过5w个ESI-Q-TOF串联质谱谱图 ### 人类代谢组数据库（HMDB） - [Human Metabolome Database (hmdb.ca)](https://hmdb.ca/) - 人体内小分子代谢物综合在线数据库 - 包括超过6500个代谢物的信息，其中有具有化学数据、临床信息和分子生物学/生物化学数据的脂质，并关联约1500个蛋白质和DNA序列 ### LipidBank - [LipidBank](http://lipidbank.jp/) - 已鉴定的天然脂质的信息，如脂肪酸、甘油磷脂、鞘脂、类固醇和各种维生素 - 包含分子结构，常规和IUPAC命名，相对分子质量，紫外、红外、核磁共振等光谱 ## 自动化脂质数据处理的生物信息学工具 ### LC-MS谱图处理 1. **获取原始数据**：根据不同机器测出来的结果，原始数据格式不同，比较常见的有.WIFF和.RAW。用相关的软件去打开就可以看到每个样本，以及每个样本的色谱图和质谱图； 2. **预处理**：这里以WIFF格式数据为例说明，包括提取一二级质谱信息，峰对齐，去除同位素峰，峰面积归一化，RSD筛选； 3. **多元统计分析**：主成分分析（PCA），偏最小二乘方-判别分析（PLS-DA)，正交偏最小二乘方-判别分析（OPLS-DA） 4. **差异筛选**：首先根据VIP>1，然后根据p-value<0.05筛选出有差异的代谢物,如果筛选出的差异代谢物还是偏多，可以根据Fold Change再进行筛选； 5. **物质定性**：分二级定性和一级定性，可以通过自建库以及metlin等公共数据库，一级有HMDB数据库等； 6. **生信分析**：有kegg通路分析，聚类热图，火山图，气泡图等等。 ### 生物统计分析和可视化 - 统计分析 - PCA从复杂的相关变量中提取有用的变量 - 基于偏最小的判别分析（PLS-DA）使用一种当需要数据降维并且在多变量辨别分析中广泛使用的有监督分类算法 > [多元统计分析PCA、PLS-DA、OPLS-DA结果傻傻分不清楚，到底有什么区别？_诺米代谢-Lambda在线 (vlambda.com)](https://vlambda.com/wz_7ieqROHIcBc.html) > > [生信学习-代谢组检测 分析之 PLS-DA_言早的博客-CSDN博客](https://blog.csdn.net/weixin_53819139/article/details/112259736) > - 多变量方差分析（MANOVA） - 可视化 - 条形图：说明脂质类别之间的质量水平变化 - 热图：显示各个分子种类之间的差异 - 热图中，脂质学数据通常以酰基链长度或总计碳数质荷比的顺序显示，有时也分为脂质亚类和/或等级聚类 - 饼图：显示组成的变化 - 多维或多色编码图示：证明脂质类别以及单个分子种类的质量水平或组成的变化 ### 脂质种类结构的解释 - 虽有诸多系统m_化的索引，但索引只有在化合物完全识别时才有意义，而脂质组学分析只能提供脂质分子的部分鉴定。 - 串联质谱中，特定的首基串联质谱通常用于分析一类脂质物质 - 只有脂质类别的信息被提供而没有亚类的区分 - m/z 184的PIS通常用于分析含有磷酸胆碱的脂质物质 - 没有将含有醚键与含有酯键的PC区分开 - 无法清除区分SM与PC，因为SM与PC的M+1的C13同位素体的潜在重叠 > 基于高质量准确度/分辨率质谱的鸟枪法脂质组学方法可解决重叠问题 > - 产物离子分析可鉴定甘油sn-1位上连接的是烷基或者烯基和二酰基脂质化合物的脂肪酰基链 - MDMS-SL法可鉴定脂肪酰基链的重叠和特定，可获得二酰基磷酸胆碱中那些脂肪酸侧链（即区域异构体）的位置 - 脂质结构的简写符号系统 - 用PC（平均质量）或PC（$m:n$）表示通过串联质谱技术检测到PC的种类 - m和n分别代表化合物的碳原子总数和脂肪酸链的双键数 - 使用PC（$m_1:n_1\_m_2:n_2$）或PC（$o-m_1:n_1\_m_2:n_2$）表示基于高分辨率质谱的鸟枪法脂质组学鉴定出的单个脂肪酰基链和醚键 - 使用PC（$m_1:n_1/m_2:n_2$）或PC（$o-m_1:n_1/m_2:n_2$）表示MDMS-SL对PC物种的总体鉴定 - 经过液质联用后并基于MRM检测分析方法鉴定的PC化合物只能表示为PC（$m:n$） ### 用于常见数据处理的软件包 #### XCMS - 开源的云代谢组学数据处理平台，用户友好，支持图形界面 - 不适用于定量分析 #### MZmine 2 - 开源数据处理工具箱，涵盖整个LC-MS数据分析工作流程，并支持高分辨率谱图处理 #### 质谱基线测定的实用方法 - 不同于基于平滑或随机截断的方法，该方法基于噪声到信号存在加速强度的变化确定在不同条件下获得的质谱的基线 #### LipidView - 商业软件，用于ESI-MS分析中脂质种类的定性和定量 - 根据母离子和碎片离子的质量即可在脂质碎片数据库中对脂质分子进行匹配，包括各个分子、各类脂质、脂肪酸和长链碱基的各项数据及谱图结果 #### LipidSearch - 商业软件，基于LC-MS和鸟枪法脂质组学获得的大量质谱数据自动识别和相对定量细胞脂质物质 #### SimLipid - 商业软件，将其于内标进行比较以分析脂质MS、MS/MS和MS$^n$数据用于结构鉴定、同位素校正和脂质定量 - 支持LC-MS和LC-MS/MS高通量数据处理，数据库包含8种脂质类别 #### MultiQuant - 商业软件，仅适用于MRM #### 鸟枪法脂质组学软件包 - LIMSA、LipidProfiler、LipidInspector、AMDMS-SL、LipidXplorer、ALEX等 - LIMSA可用作处理来自单个全扫描质谱和串联质谱数据的界面 - LipidXplorer处理多个前体离子扫描和中性丢失扫描数或其它采用高质量精度/高质量分辨率的一起获取的数据 - AMDMS-SL 最后修改：2021 年 07 月 14 日 © 允许规范转载 赞 如果觉得我的文章对你有用，请随意赞赏