Loading... # Long-term exposure to TET increases body weight of juvenile zebrafish as indicated in host metabolism and gut microbiome # 关键词 * Zebrafish 斑马鱼 * Tetracycline 四环素 * Metabolism 新陈代谢 * Lipid accumulation 脂肪堆积 * Gut microbiome 肠道微生物组 # 引言 * 研究四环素对斑马鱼等水生生物，尤其是胚胎和幼鱼的毒性效应 * TET的影响： * 体长减少，孵化推迟，卵黄囊面积增加，低于20 µg/L时无鱼鳔 * 胚胎氧化应激相应增强，同时存在细胞凋亡 * 缺乏TET对斑马鱼发育成年的影响 * 抗生素对斑马鱼肠道微生物的影响及其宿主效应有待研究 * 将1月龄斑马鱼暴露于TET中至成年，观察到 * 鱼体重增加 * 体长无变化 * 肝脏组织学异常，代谢紊乱，尤其是肝脏脂质的增加 * 分析肠道微生物群落表明TET可改变肠道微生物群落组成，增加细菌多样性 # 方法与结果 * 斑马鱼养殖 * 制备暴露盐酸TET溶液 * 测量水生环境和地面水两种环境，分别为158 μg/L和320 μg/L * 选择1 μg/L和100 μg/L分别代表低和高浓度环境 * 60 dpf，选取120条鱼，分3组，每组4缸，每缸10条。两组TET，一组无暴露 * 半静态流动条件，5天补充新鲜培养基。经过30天后，处死斑马鱼，测量体重和体长，解剖，-80°C 冻存肝脏标本和肠道标本 * **结果：** * 无明显畸形 * 体重显著增加，体长不变 * 肝组织病理学分析 * 接触抗生素和增加体重可能改变肝功能 * 解剖肝脏标本，固定4% PFA中，每个鱼缸取一条鱼，每次4次重复。制备肝侧平面的石蜡切片，用苏木精-伊红染色，观察组织形态学变化 * **结果：** * 观察到染色质核浓缩、脂质空泡 * 推测暴露于TET可能造成体重增加 * 基因表达 * 实时荧光定量PCR肝脏基因 * 以18s rRNA为管家基因，使靶基因表达正常化 * 代谢产物和脂质提取 * 每个鱼缸中取3条斑马鱼的肝脏组织混合，做4次重复。 * 每个组织样本中加入1 mL 冷甲醇：H~2~ O（4:1,v/v），均质，冰浴超声10 min * 转移至1.5 mL EP管，用200 μL的萃取溶剂冲洗样品，将每个样品中的1.2 mL联合萃取液按5:1（v/v）的比例分离成两个组分，分析代谢产物和脂质 * -20 °C下培养1 h，在13000 rpm下离心15 min沉淀蛋白质。真空蒸发上清液，定量沉降蛋白。 * 沉降物重新溶于乙腈：水（1:1，v/v），利用蛋白质含量归一化。 * 超声10 min，离心上清液转移至液相小瓶中，-80 °C保存。 * 样品中加入MTBE至MTBE：甲醇（20:6，v/v），超声30 min，加入HPLC级水使比例达到MTBE：methanol：H2O（20:6:7），开始分离。 * 4 °C离心15 min，收集上清液，干燥，溶解于三氯甲烷/甲醇（2:1，v/v）中至蛋白含量归一化体积。 * 代谢产物分析、鉴定和通路分析 * HPLC * 混合对照组和受试组样品，利用DDA auto-MS/MS和选定前体的靶向MS/MS * 利用XCMS处理代谢组学数据 * 首次筛选基于显著特征，p ≤ 0.05，倍数变化 > 1.2，强度 > 10000离子计数 * 鉴定方法：MS/MS片段匹配，准确质量匹配和内部保留时间匹配 * 通路分析：KEGG * 热图分析：r * 脂质组分析鉴定 * **结果：** * 脂质失调特征：100µg/L TET 比1 µg/L高1.2倍 * * DNA提取和Illumina MiSeq平台测序 * 每个鱼缸中取3条鱼为一个样本，重复3次。 * 提取DNA，使用引物组 338F 5′-actcctacgggaggcag-3′和 806R 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′扩增每份样本16S rRNA的V3-V4可变区。原始序列数据的分析在上海Majorbio生物技术有限公司基因组研究中心进行。中国有限公司，Illumina MiSeq配对末端300 bp方案。使用QIIME 1.7.0处理原始序列数据，然后根据QIIME 97%序列相似性的标准聚类为操作分类单元(OTU)。将归一化序列与SILVA数据库比对，以70%阈值聚为不同的分类水平（包括门、纲、目、科、属）。TET处理和对照斑马鱼肠道微生物群落的比较包括非度量多维标度(NMDS)分析和Bray-Curtis指数计算通过PAST（[https://folk.uio.no/ohammer/past/](https://folk.uio.no/ohammer/past/)).使用16s rRNA基因序列功能预测的预测性宏基因组方法，其中使用未观察状态重建社区系统发育研究(PICRUSt)预测KEGG类别，并纳入功能酶研究微生物群落的功能变化。 最后修改：2021 年 09 月 21 日 © 允许规范转载 赞 如果觉得我的文章对你有用，请随意赞赏