Loading... # Lipopolysaccharide-induced TNFα factor (LITAF) promotes inflammatory responses and activates apoptosis in zebrafish # 脂多糖诱导的斑马鱼 TNFα 因子(LITAF)促进炎症反应和细胞凋亡 [来源](https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378111921000810?via%3Dihub) # TNFα，Tumor necrosis factor alpha，关键的炎性细胞因子 * 作用：调节炎症、凋亡、homing（制导） * 过量导致：触发产生线粒体活性氧，致使细胞坏死。 * 表达： * 核因子κB * C/EBP * LPS-induced TNFα factor（LITAF），被称为p53-inducible gene 7（PIG7） # PIG7 * 作用： * 诱导TNFα的表达 * 参与IL-lα, IFNγ和IL-10细胞因子的调节 * 使用shRNA敲除可促进前列腺癌细胞的增殖及肿瘤等发展等 * 转录调节： * Bcl6调节其转录等 # 细胞炎症因子表达 * LITAF的结构： * 一个保守的LITAF结构域 * 两个锌指结构，分别位于N与C末端（RING-finger CXXC motifs） * 脂多糖激活后，CXXC形成一个紧密的和膜相关的Zn2+结构，同时促进p38α介导的LITAF磷酸化 * 磷酸化的LITAF结合信号转导子和转录激活子6B（STAT6B）形成复合物，进入细胞核 * 与靶基因启动子区的DNA序列（CTCCC）结合 * 激活炎症细胞因子的表达，包括：TNFα, IFNγ, IL-1α and IL-10 # 实验 ## 分析DrLITAF的序列 ### 实验方法 * 预测跨膜区域、等电点、分子量 * 预测结构域 ### 结果 * 163个氨基酸、理论分子量17.4kDa，pI5.58。 * 与人类LITAF具有39。7%氨基酸同源性 * 包括4个外显子和3个内含子，编码区跨越2、3、4外显子。 ## 分析DrLITAF在组织和胚胎中的表达 ### 实验方法 * 从胚胎中提取RNA * 受精10h后，收集50个胚胎；再分别从受精24、48、72小时的胚胎中，收集30个。 * 从成年鱼内脏中提取 * 取成年鱼的肝、脾、肾、肠、皮肤和鳃共6个组织样品。 * 定量rt-PCR检测。 > knock in：对特定组织转入某基因 > rt-PCR，反转录PCR，RNA链被逆转录为cDNA，以此为基础进行扩增 ### 结果 * 最高表达在鳃，最低为肝 * 注射LPS后 | 组织 | 12h | 24h | 48h | 72h | | ------ | ----- | ----- | ----- | ----- | | 脾 | 1 | 1 | 5.5 | 1.9 | | 肾 | 2.1 | 1 | 1 | 0.6 | * 注射poly(I:C)后 | 组织 | 12h | 24h | 48h | 72h | | ------ | ----- | ----- | ----------- | -------- | | 脾 | 1.9 | 0.8 | 2.3，高峰 | 几乎无 | | 肾 | 2.2 | 1.3 | 6.8，高峰 | 4.2 | * 感染E.tarda 后 | 组织 | 6h | 12h | 24h | | ------ | ----- | ----- | ----- | | 脾 | 1.3 | 0.3 | 3.4 | | 肾 | 2.4 | 1.7 | 2.1 | * 感染A.hydrophila后 | 组织 | 6h | 12h | 24h | | ------ | ----- | ----- | ----- | | 脾 | 0.9 | 1.1 | 3.7 | | 肾 | 2 | 1.7 | 1.1 | * 感染SVCV后 | 组织 | 1d | 3d | 5d | 7d | 15d | | ------ | ----- | ----- | ----- | ----- | ----- | | 脾 | 5.4 | 0.8 | 2.1 | 1.8 | 2.2 | | 肾 | 1.9 | 4 | 2.1 | 2 | 1.7 | ## PAMPs、病毒和重组细胞因子对DrLITAF在ZF4细胞中表达的影响 > 斑马鱼ZF4细胞系：1天的斑马鱼胚胎细胞培养得来\ > [DMEM-12](https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11320033#/11320033)：Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12，用于支持多种哺乳动物细胞生长。如：MDCK、胶质细胞、成纤维细胞、人内皮细胞及小鼠成纤维细胞。 ### 实验步骤： * 使用10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的DMEM/F12培养基,28摄氏度CO~2~培养箱培养ZF4 * 达到80%融合度，使用LPS（100μg/mL）、PHA（50μg/mL）、PMA（0.5μg/mL）、DMSO or PBS体系分别刺激细胞6、12小时 * 用TCID~50~/mL和等体积的DMEN混合，感染细胞 分别与12、24、48小时后进行表达分析 * 分别使用终浓度为20 ng/mL的rIFNφ1 和 rIFNφ4 刺激ZF4细胞，对照组用蛋白缓冲液培养。 * 12h后收集细胞进行表达分析 > PHA： > PMA： > DMSO： > PBS： > TCID： > rIFNφ1 和 rIFNφ4： ### 实验结果： * 不受PHA和Poly(I:C)的影响。 * LPS刺激ZF4，6h与12h，DrLITAF的表达明显升高 * PMA刺激使DrLITAF的表达下降 * rIFNφ1 和 rIFNφ4： * MxA：被显著诱导 * DrLITAF：不受影响 > MxA： ## 注射LPS或ploy(I:C)对鱼体DrLITAF表达的影响 ### 实验步骤： * 腹腔注射，注射物分三组 | | LPS | poly(I:C) | PBS | | ------------- | ----- | ----------- | ------ | | 浓度 μg/mL | 100 | 100 | 对照 | | 体积 μL | 10 | 10 | 10 | ## 感染致病菌和病毒后对鱼体DrLITAF表达的影响 ### 实验步骤 * 致病菌和病毒包括迟缓爱德华氏菌、嗜水气单胞菌和SVCV * 迟缓爱德华氏菌接种至TSA，28摄氏度培养一夜，转移一个菌落至10mL TSB； * 嗜水气单胞菌接种至LB琼脂培养基培养一夜，转移一个菌落至LB肉汤培养基。 * 均于28摄氏度下170 rpm摇动过夜。 * 1:100(v/v)稀释培养基培养至对数生长期（OD600=0.6·0.8） * 4000rpm离心5min * 无菌PBS洗涤3次，于PBS中复苏 * 平板计数法测定细菌浓度 * 每组取70尾成年斑马鱼静脉注射10 μL： * 迟缓爱德华氏菌：5×10^5^ CFU/mL * 嗜水气单胞菌：5×10^4^ CFU/mL * 注射后6、12、24h，取每组5条鱼的脾和肾于含1 mL TRIzol试剂的EP管中，提取RNA。 * 每条鱼注射10 μL 1×10^7^ TCID~50~ /mL SVCV 或 10 μL DEME。 > TCID~50~：50%细胞感染量 > DEME：含各种氨基酸和葡萄糖的培养基 ## 亚细胞定位 ### 实验步骤 * 使用EGFP作为报告基因构建pEGFP-N1-DrLITAF质粒研究DrLITAF的亚细胞定位 * 使用poly-L-lysine处理盖玻片，培养HEK293T和ZF4细胞过夜 * 使用lipofectamine 3000试剂分别转染2.5μg pEGFP-N1-DrLITAF或pEGFP-N1（plasmid vector） * 24h后，使用100 μg/mL LPS 或者PBS刺激细胞3h * PBS洗涤3次 * 室温下用4%(v/v)多聚甲醛固定20min * 用增强免疫染色渗透缓冲液培养10min * 用10 μL DAPI染色5min * 转染24h后，用ER-Tracker Red和Lyso-Tracker对细胞内质网和酶体进行染色 * 用激光扫描共聚焦显微镜扫描拍照 > lipofectamine 3000： > 多聚甲醛固定： > enhanced immunostaining permeabilization buffer： ### 实验结果 * 在HEK293T和ZF4细胞中，表达带有GFP标签的DrLITAF融合蛋白 * 转染后24h，用LPS刺激细胞3h，GFP位于细胞和内，不受LPS的影响 * 在转染GFP-DrLITAF的HEK293T细胞中，GFP-DrLITAF主要分布在细胞膜、核膜以及与核膜相关的亚细胞结构中。 * LPS刺激可使部分细胞内的DrLITAF部分移位至细胞核内。 * 转染pEGFP-N1-DrLITAF后，细胞表现出细胞膜受损 * 在转染DrLITAF的ZF4细胞中。GFP-DrLITAF位于内质网，而不是溶酶体 ## DrLITAF的凋亡作用 ### 实验步骤 * 以pEGFP-N1-DrLITAF为模板，CMV-F和pcDNA3.1-LITAF-R为引物进行PCR扩增，构建真核表达质粒pcDNA3.1-DrLITAF。 * 使用poly-L-lysine处理盖玻片，培养HEK293T细胞过夜 * 转染2.5 μg的pcDNA3.1-DrLITAF或pcDNA3.1（plasmid vector） * 用Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒检测DrLITAF转染后24h和36h对细胞的凋亡作用 * 收集300g离心5min后的细胞 * 用冰PBS洗涤2次 * 在结合缓冲液中复苏 * 用Annexin V-FITC和PI染色 * 使用flow cytometry分析样本，检测相关基因的表达 * caspase 3, caspase 6, caspase 7, TNFα, p53, Bcl2 and Bax * qRT-PCR ### 实验结果 * 转染pcDNA3.1-DrLITAF质粒后，HEK293T细胞在12h表现出明显的生长迟缓 * 转染后12、24和36h，TNFα的表达分别增加了2.2、20.0和4.4倍 * Caspase 3在36h和Bcl2在24h与36h时，表达增加。 * 转染DrLITAF后24、36h细胞凋亡率明显高于转染载体的对照组 * 24h->13.3%和1.16%；36h->18.4%和2.24% # 讨论 * LITAF的c末端结构域在不同物种中具有高度相似性，表面其某些功能在进化上是守恒的 * DrLITAF在鳃中的表达水平比其他组织高得多 * 鉴于鳃不断暴露于外部病原体，猜测LITAF可能参与细胞 维持细胞稳态和器官的发育 * 可能具有维持鳃的生理功能和发挥免疫防御作用 * LPS和细菌都是已知的炎症活化因子，感染E.tarda和A.hydrophila均表现出强烈的炎症反应。并增加促炎症细胞因子的表达 * 由于LPS刺激或细菌感染，DrLITAF表达增加，因此其参与了炎症的调节 * LITAF在感染SVCV的鱼的肾和脾中表达，说明其参与了抗病毒反应。但在ZF4细胞中，SVCV、poly(I:C)和IFNs的刺激并没有改变DrLITAF的表达。推测其可能在白细胞和成纤维细胞等细胞类型中发挥不同作用。LITAF表达的增加可能促进感染了病毒的白细胞凋亡，从而限制病毒的传播，但需进一步研究。 最后修改：2021 年 09 月 19 日 © 允许规范转载 赞 如果觉得我的文章对你有用，请随意赞赏